A humán RAD51 rekombináz enzim funkcionális szerkezetvizsgálata triptofán-mutánsok segítségével
A humán RAD51 fehérje kulcsszerepet játszik a DNS kettőstörések homológ rekombinációval történő hibajavításában. Az egyszálú DNS-en hélixes szerkezetű ún. preszinaptikus filamentumot képez, majd az ép, kétszálú DNS-en a megfelelő szakaszt megkeresve segíti a szálcserét. Célul tűztük ki, hogy a hRAD51-preszinaptikus filamentum felépülését fluoreszcens módszerekkel vizsgáljuk. Feltételezhető, hogy az összeszerelődés során a fehérje térszerkezete változik, s ez egy megfelelő fluoreszcens jelben is látható lehet. A hRAD51 nem tartalmaz triptofánt, ezért a vizsgálathoz fluoreszcens jelölőanyagot kell használni, vagy magát a fehérjét kell megváltoztatni. Ez utóbbi lehetőség ígéretesebb a belső szerkezetváltozások megfigyelésére. A hRAD51 teljes natív térszerkezete nem ismert, ezért a kicserélendő aminosavakat homológ szerkezetek alapján választottuk ki. Olyan aminosavakat kellett választani, amelyek a határfelületre lehetnek jellemzőek, de a csere nem okozza a funkció jelentős sérülését; ill. hogy a határfelület közelében, de ne a felszínen legyenek, hogy így a belső változásokat is észlelhessük. Három mutánst állítottunk elő, melyekben fenilalanint, tirozint ill. hisztidint cseréltünk le triptofánra (F126W, Y191W és H294W). A mutánsok lehetőséget adnak a fluoreszcencia spektrumok összehasonlítására, élettartam-mérésekre és kioltási vizsgálatokra, melyek során képet kaphatunk a választott aminosav exponáltságáról, és a fehérje térszerkezet-változásáról. A mutáns géneket tartalmazó vektorokat előállíttattuk, a szekvenciákat ellenőriztük és E. coli BL21(star)pLysS sejtekbe transzformáltuk. Kidolgoztuk a tisztítási protokollt, a kinyert fehérjeoldat tisztaságát gélelektroforézissel ellenőriztük. A mutánsok közül az F126W-t vizsgáltuk részletesen. Megállapítottuk, hogy nagy mennyiségben expresszálódik, és a tisztítás során erősen koncentrálódik. Elektronmikroszkópos felvételekkel igazoltuk, hogy filamentumot képez. Fluoreszcencia anizotrópiai méréseink azt mutatják, hogy a vad típushoz hasonlóan, de kisebb asszociációs állandóval ködődik az ssDNS-hez. A DNS-kötés hatása jól mérhető változást okoz a fluoreszcencia spektrumban. A továbbiakban ezen eredmények felhasználásával lehetőség van a filamentum felépülésének dinamikai vizsgálatára.
A humán RAD51 fehérje kulcsszerepet játszik a DNS kettőstörések homológ rekombinációval történő hibajavításában. Az egyszálú DNS-en hélixes szerkezetű ún. preszinaptikus filamentumot képez, majd az ép, kétszálú DNS-en a megfelelő szakaszt megkeresve segíti a szálcserét. Célul tűztük ki, hogy a hRAD51-preszinaptikus filamentum felépülését fluoreszcens módszerekkel vizsgáljuk. Feltételezhető, hogy az összeszerelődés során a fehérje térszerkezete változik, s ez egy megfelelő fluoreszcens jelben is látható lehet. A hRAD51 nem tartalmaz triptofánt, ezért a vizsgálathoz fluoreszcens jelölőanyagot kell használni, vagy magát a fehérjét kell megváltoztatni. Ez utóbbi lehetőség ígéretesebb a belső szerkezetváltozások megfigyelésére. A hRAD51 teljes natív térszerkezete nem ismert, ezért a kicserélendő aminosavakat homológ szerkezetek alapján választottuk ki. Olyan aminosavakat kellett választani, amelyek a határfelületre lehetnek jellemzőek, de a csere nem okozza a funkció jelentős sérülését; ill. hogy a határfelület közelében, de ne a felszínen legyenek, hogy így a belső változásokat is észlelhessük. Három mutánst állítottunk elő, melyekben fenilalanint, tirozint ill. hisztidint cseréltünk le triptofánra (F126W, Y191W és H294W). A mutánsok lehetőséget adnak a fluoreszcencia spektrumok összehasonlítására, élettartam-mérésekre és kioltási vizsgálatokra, melyek során képet kaphatunk a választott aminosav exponáltságáról, és a fehérje térszerkezet-változásáról. A mutáns géneket tartalmazó vektorokat előállíttattuk, a szekvenciákat ellenőriztük és E. coli BL21(star)pLysS sejtekbe transzformáltuk. Kidolgoztuk a tisztítási protokollt, a kinyert fehérjeoldat tisztaságát gélelektroforézissel ellenőriztük. A mutánsok közül az F126W-t vizsgáltuk részletesen. Megállapítottuk, hogy nagy mennyiségben expresszálódik, és a tisztítás során erősen koncentrálódik. Elektronmikroszkópos felvételekkel igazoltuk, hogy filamentumot képez. Fluoreszcencia anizotrópiai méréseink azt mutatják, hogy a vad típushoz hasonlóan, de kisebb asszociációs állandóval ködődik az ssDNS-hez. A DNS-kötés hatása jól mérhető változást okoz a fluoreszcencia spektrumban. A továbbiakban ezen eredmények felhasználásával lehetőség van a filamentum felépülésének dinamikai vizsgálatára.
1 megjegyzés:
ezt már tegnap is akartam mondani:)
Megjegyzés küldése